Bactériophage

Le phage S-PM2

Dans les années 1960, des recherches de pointe menées sur les mécanismes hôte/phage par des physiologistes américains, Max Delbrück, Alfred Hershey et Salvador Luria, valurent à ces chercheurs le prix Nobel de médecine-physiologie en 1969.

Article détaillé : expérience de Delbrück et Luria.

Les phages ont permis différentes découvertes :

• L'expérience de Hershey et Chase qui a permis de confirmer la fonction de l'ADN comme support de l'information génétique. Hershey et Chase incorporèrent du phosphate 32 dans l'ADN d'une culture de phage et du soufre 35 dans les protèines d'une autre culture de ce même phage. Puis, ils utilisèrent chacune de ces culture de phage indépendamment pour infecter E. Coli à raison d'un nombre élevé de particules virales par cellule bactérienne. Après un temps suffisant pour que l'infection ait eu lieu, ils détachèrent les enveloppes vides des phages (ghosts) des cellules bactériennes par agitation mécanique. Par centrifugation, ils séparèrent les cellules bactériennes des ghosts et mesurèrent la radioactivité des deux fractions obtenues. En utilisant les phages marqués au 32P, l'essentiel de la radioactivité aboutissait dans les cellules bactériennes, indiquant que l'ADN de phage entre dans les cellules. Au contraire, le 35S restait dans les ghosts montrant que les proteines du phage n'avaient jamais pénétré dans la cellule bactérienne. Conclusion : l'ADN est le materiel héréditaire alors que les proteines de phages ne sont qu'un emballage qui est eécarté une fois que le précieux ADN à été injecté dans la cellule bactérienne.

• En 1980, le biochimiste britannique Frederick Sanger reçut le prix Nobel pour avoir réussi à séquencer l'ADN en utilisant un phage. Le premier organisme biologique dont le génome a été séquencé est un phage (interet étant du à son ADN simple brin). Protocole de la méthode de séquancage : incubation de l'ADN à séquancer avec une amorce, le fragment de Klenow (ADN pol I depourvue d'activité exonucléasique 5'->3'), les 4 désoxyribonucléotides (dNTP) et 1 didésoxyribonucléotide (ddNTP) en faible concentration. Le ddNTP induit l'arret de l'élongation : l'ensemble des fragments obtenus se termineront par ce nucléotide. Dans la mesure où il est utilisé en faible concentration, on va obtenir des fragments de tailles differentes. On refait l'experience avec les 4 ddNTP. Les fragments sont scindés par electrophorese sur gel de polyacrilamide.

• Les 1eres experiences suggerant un ARN intermediaire dans la synthese proteique. Il s'agit de l'experience de E. Volkin et L. Astrachan en 1957. Ils font une experience de pulse chase dans laquelle l'ARNm est marqué de facon spécifique avec de l'uracile radioactif. Ils constatent que l'infection par un bacteriophage T2 induit une augmentation de la quantité d'ARNm dans la cellule hote et que cet ARNm a un temps de vie tres court (car tres vite degradé apres le marquage). Conclusion : l'ARN joue un rôle intermediaire entre l'ADN et les proteines.

• La decouverte des enzymes de restriction en 1962 par W. Arber. Prococole de l'expèrience : On infecte 2 souches bacteriennes A et B par un phage X puis on récupère le lysat de phage pour l'utiliser dans une nouvelle infection dans les deux souches bacteriennes utilisées précédamment. Résultat : le phage X-A peut infecter les 2 souches bacteriennes alors le phage X-B ne peut pas infecter la souche A. Conclusion : les phages ont une spécificité d'hote qui dépend de la souche dans lequel il s'est developpé et pas de son génotype. Cette restriction d'hote est du a la méthylation de l'ADN par des enzymes spécifiques sert à protéger l'ADN viral de la degradation par des nucléases de la bactérie. Ces nucléases sont enfaite des enzymes de restriction qui ne reconnaissent que la forme non méthylé de leur site de coupure. L'enzyme necessaire a cette méthylation n'est présente que dans la souche A par conséquent seul le phage X-A est méthylé par conséquent seul lui n'est pas degradé par les nucléases. Ce mécanisme permet a la bacterie de differencié son propre ADN de l'ADN etranger.

• La recherche en génétique sur la structure des génomes par Benzer. Celui ci à déterminer la structure fine des genes grace à l'étude de recombinaisons entre mutants de bactériophage T4. Les bactériophages présentent deux avantages énormes : la fréquence de recombinaison est élevée, la descendance est quasi infinie ce qui permettra d'avoir accès à des événements particulièrement rares.

L'étude des phages a des implications importantes en médecine et en génétique, surtout pour la compréhension des infections virales, des anomalies génétiques, de l'embryologie humaine, des causes du cancer et de la résistance des bactéries aux antibiotiques.

Utilisation en génie génétique

Les phages sont utilisés de multiples manières dans la biologie moléculaire. Ils sont utilisés comme vecteurs de clonage pour insérer de l'ADN dans les bactéries. La méthode du phage display est une méthode qui permet la sélection d'un peptide grâce à sa présentation sur la surface de phages. Le phage display forme une catégorie de phage donnant la possibilité la construcution de banques d'ADN ou d'ADN complémentaire. Les 2 principaux phages utilisés dans cette technique sont les phages M13 (phage filamenteux) et lambda qui infectent l'ensemble des 2 E. Coli. Prenons l'exemple du phage M13 qui est un phage filamenteux capable d'infecter seulement les bactéries gram (-) ayant incorporé le facteur F et dont l'infection conduit à la lysogénie. Sa capside contient, entre autres, les proteines P8 et P3 necessaire pour la liaison du bactériophage à la bactérie via les pilis sexuels. Ces 2 proteines vont etre utilisé pour présenter à la surface des phages des molécules d'interet (peptide, fragment d'anticorps ou proteine entiere)  : On va faire fusionner notre molécule d'interet avec les proteines P7 et P3, pour cela il faut inserer le gène codant la molécule d'interet à proximité de l'extremité 5'des genes P3 et P7 en respectant le cadre de lecture. On utilise l'une ou l'autre des proteines selon le type de molécule et la quantité de molécules qu'on veut exposer à la surface du phage. On peut distinguer les phages polyvalent/homogene, où l'ensemble des proteines P3 et P7 sont fusionnées, des phages monovalents/hétérogene ou uniquement une partie des proteines le sont . Interet de la technique : elle permet d'obtenir des banques d'ADN qu'on peut aisément conserver et les clones selectionnés sont multipliés à faible coût. Cette technique va permettre de produire des anticorps sans devoir passer par l'immunisation d'un animal. Limite de la technique : certaines molécules ne peuvent pas etre exprimées comme par exemple les molécules toxiques pour la cellule hôte. Il y a par conséquent une capacité limiter à transformer E. Coli.

Utilisation dans le séquençage de génomes entiers

Le séquençage d'un génome ne se fait pas d'un seul coup, mais progressivement sur des fragments de génomes. Pour cela ces fragments d'ADN doivent être stockés et multipliés dans des organismes servant de banque d'ADN. Les phages comme vecteurs de clonage le permettent.

Article détaillé : Projet génome humain.

Utilisation des phages comme agent anti-microbien

• Les phages detruisent les bacteries en s'y reproduisant massivement, on peut par conséquent les utiliser dans la lutte contre les bactéries resistantes aux antibiotiques. On parle par conséquent de phagothérapie. Les bacteriophage ont été decouvert avant les antibiotiques mais ce sont ces derniers qui ont été retenu comme thérapie anti bacterienne car ce sont des molécules inertes clairement définies et pour lesquels on maitrise idéalement les méthodes de préparation contrairement aux bactériophagex qui sont eux des etres vivants. Mais actuellement les phages reviennent de plus en plus au devant de la scène précisément à cause du développement important de résistances bactériennes face aux antibiotiques. Ils sont utilisés uniquement en Géorgie et en Pologne par 2 cliniques, mais au contraire de l'avis de certains occidentaux qui pensaient que "le suivi des patients y est insuffisants pour qu'on puisse en tirer des publications scientifiques rigoureuses" (tel que cela fut rédigé dans la version antérieure de cet article), il existe bel et bien des publications médicales minutieuses et fiables, sur divers traitements effectués sur suffisamment d'années et de patients. Mais comme il s'agit d'articles en russe ou en géorgien, ils sont rarement connus des médecins occidentaux. Ils sont pour la majorité disponibles à la bibliothèque de l'Eliava Institute[1], mais aussi dans quelques bibliothèques universitaires des pays de l'Est ou de l'ex-URSS.

• En 2006, aux États-Unis, une préparation à base de six virus bactériophages a été autorisée comme conservateur alimentaire, surtout, pour lutter contre la listériose.

[2]

Utilisation en Médecine

En ex-URSS et surtout en Géorgie et en Pologne, les phages sont utilisés pour traiter les infections bactériennes avec ou sans adjonction de traitement antibiotique. Dans de nombreux cas, les phages sont aussi efficaces que les antibiotiques et fréquemment même supérieurs, surtout dans les cas d'infections chroniques. [3] [4]

Néanmoins, il est quelquefois émis qu'à l'instar des antibiotiques, ce traitement pourrait participer à la sélection de souches bactériennes résistantes, faisant qu'on pourrait peut-être craindre à terme que certaines bactéries soient insensibilisées à certaines phagothérapies, comme à l'antibiothérapie. Pour tout autant, ce raisonnement ne saurait interdire l'utilisation des "phages", auquel cas il faudrait aussi abandonner les antibiotiques. En outre, quoiqu'il soit partiellement fondé, cet argument est à relativiser du fait que les bactériophages co-évoluent naturellement de manière presque synchrone face aux résistances des bactéries, ce qui n'est pas le cas des antibiotiques. Par conséquent, si leur utilisation est bien encadrée, elle forme une piste sérieuse dans la découverte de traitements durables contre les infections bactériennes.

Liste des principaux bactériophages

• phage λ - lysogène
• phage T4 (169 à 170 kilopaires de bases, 200 nm de long)
• phage T7
• phage R17
• phage M13 - Phagemid

Voir aussi

"Des virus pour combattre les infections" (240 p., 2008, éd. Favre), par le docteur Alain Dublanchet.

• Félix d'Herelle